熒光-PCR法中的普通PCR和qPCR引物設(shè)計原則有哪些區(qū)別呢？

　　一、二者的相同之處

　　序列的查找是一致的；

　　序列選取應在基因的保守區(qū)段；

　　選取合適的擴增片段大小

　　避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對；

　　避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)；

　　Tm值在55-65℃，GC含量在40%-60%；

　　引物之間的TM相差避免超過2℃；

　　引物的3’端避免出現(xiàn)3個或3個以上連續(xù)相同的堿基。

　　二、二者的不同之處

　　qPCR產(chǎn)物長度PCR要求在300bp以內(nèi)，一般先選80-150bp之間；多對目的基因同時擴增，文獻上查來的引物條件會不同，需要設(shè)計盡可能條件一致的引物；目的基因含量比較低時，需要設(shè)計靈敏度比較高的引物；相對電泳法，qPCR靈敏度比較高，對引物的要求更高，引物二聚體要少，熔解曲線要求單一產(chǎn)物；PCR的目的是進行定量或者相對定量，對擴增的效率有要求，對引物的二級結(jié)構(gòu)要求高。

　　普通PCR引物根據(jù)實驗的要求不同，長度一般是從150bp到幾千bp不等；對二級結(jié)構(gòu)要求沒有qPCR高；對擴增效率要求不高；可選用梯度PCR儀，選擇不同退火溫度，對引物退火溫度要求不需要一致。